2011 m. birželis 19 d., sekmadienis

Žmogaus genetika


1. ZMOGAUS LASTELIU KULTUROS: TRIDIENE, ILGALAIKE. NUOLAT PERSEJAMOS KULTUROS. LASTELIU IMORTALIZACIJA.

Tridiene kultura: naudojama citogenetiniame metode (sio metodo esme – pakitusio kariotipo lyginimas su normaliu). Kadangi chromosomos buna stebimos tik besidalijancioje lasteleje, tiesioginu metodu tiriamos tik intensyviai besidalijanciu audiniu lasteles. Placiausiai naudojama tridiene zmogaus leukocitu kultura. Zmogaus lasteles periferiniame kraujyje nesidalija, todel 0,5 ml tiriamo kraujo specialiuose plastikiniuoe indeliuose uzpilama audiniu terpe, kurioje yra preparatas, priverciantis limfocitus nuolat dalintis. Didziausias susidaranciu mitoziu skaicius pasiekiamas po 64-72 val., todel kultura vadinama tridiene. Kultivavimo pabaigoje i terpe ilasinama kolcemido: sis preparatas ardo mitozes dalijimo verpste, ty uzfiksuoja mitoze metafazes stadijoje.

Ilgalaike kultura: citogenetinio metodo variacija. Tyrimo objektas – audiniu lasteles, auginamos maitinamojoje terpeje. Jos dalijasi, sintetina baltymus. Taip galima tirti funkcionavima, galima identifikuoti atskirose chromosomose esancius genus, tirti mutagenu poveiki. Tiriant amniono skyscius, placentos gabaliukus galima nustatyti paveldimas ligas iki gimimo.

Nuolat persejamos kulturos: kultivuojant lasteles jos prisitvirtina prie indelio dugno. Is pradziu lasteles dalijasi retai, paskui dazniau, kol aptraukia istisiniu sluoksniu visa indo dugna. Susidarius keliems sluoksniams, lasteles dalijasi vis reciau, kol praktiskai visai nustoja dalytis. Tada kultura persejama (subkultivuojama): tripsinu ir versenu lasteles „atklijuojamos“ nuo dugno ir viena nuo kitos, praskiedziamos sviezioje terpeje ir sejamos i naujus indelius. Perseta kultura intensyviau dalijasi, mitozes labiau sinchronizuojasi. Optimalus mitozinis aktyvumas pasireiskia po 2-3 savaiciu kultivavimo.

Lasteliu imortalizacija: subkultivacijos (persejimo) negalima testi iki begalybes. Lasteles kulturoje dalijasi ne daugiau kaip 50-70 kartu, po to jos zuva. Tad norint issaugoti kultura ji buna konservuojamos – uzsaldoma skystame azote. Prireikus sia kultura galima atsildyti ir kultivuoti toliau. Dazniausiai uzsaldomi klonai su chromosomu aberacijomis (kai reikia lasteles persiusti i kita laboratorija arba palaukti, kol bus rasti nauji biocheminio ar kito tyrimo metodai).  

2. ZMOGAUS KARIOTIPAS. TRUMPUJU IR ILGUJU PECIU SKIRSTYMAS I RAJONUS IR SEGMENTUS, G, Q, R, C RUOZAI.

Kariotipas: rusiai budingas chromosomu skaicius, dydis, forma, kiti morfologiniai ypatumai.Tai organizmo chromosomu visuma. Zmogaus kariotipas 46 XX (XY). Pagal Denverio nomenklatura zmogaus chromosomos isdestomos pagal dydi i septynias grupes A, B, C, D, E, F, G, plius lytines chromosomos.  

Specialiais dazymo metodais galima nustatyti chromosomu linijines diferenciacijos ypatybes ir identifikuoti visas zmogaus kariotipo chromosomas. Skiriami keturi pagrindiniai chromosomu linijiniu strukturu tipai. Pagal dazymo metodu pavadinimus jie vadinami Q, G, R ir C segmentais.
Q metodu chromosomu preparatai buna laikinai imerkiami i spiritinius ir buferinius tirpalus. Objektiniai stiklai buna dazomi fluorochromais, ir tada laikini preparatai buferio lase buna tiriami mikroskopu. Daugelis flurochromu suzadinami gyvsidabrio-kvarco lempomis su sviesos filtrais. Emisinis spektras emituoja zalia, oranzini ar raudona svytejima. Pagal svytejimo intensyvuma galima atskirti visas chromosomas. Kiekvienos chromosomos piesinys yra specifinis pagal svytinciu segmentu kieki, diduma ir padeti. Q ruozuotumas siejamas su netolyginu azotiniu baziu (A, C, G, T) pasiskirstymu. Intensyviau svyti chr. segmentai, kuriuose daugiau A ir T, todel Q ruozai laikomi siu baziu sankaupu indikatoriais.
G ruozai atsiranda nefluorescuojanciais baziniais dazais ir ju misiniais dazomose chromosomose. Pagal nusidaziusiu segmentu kieki, diduma ir issidestyma G ruozai atitinka Q ruozus, todel nusidazymas vel siejamas su AT nuleotidu poru sankaupomis DNR strukturoje. G ruozuotumo dazymo metodas dar vadinamas bendingu (angl. banding).
R metodu dazomi ruozai kurie nesidazo G metodu, ty R teigiami segmentai atitinka G neigiamus segmentus. Taigi, R ruozai laikomi CG nuleotidu poru sankaupomis DNR strukturoje. Chromosomos nusidazo ne taip intensyviai kaip kitais metodais.  
C metodu dazosi visu chromosomu centromeros bei gretimi segmentai. Be sio centromerinio heterochromatino dar dazosi: 1) antriniu persmauku heterochromatinas 1, 9 ir 16 chromosomoje; 2) akrocentriniu chr. trumpuju peciu heterchromatinas; 3) Y chromosomos ilgojo peties heterochromatinas. Pagal C ruozus galima geriau ivertinti chromosomu polimorfizma, patikslinti chr. aberaciju pobudi.       

3. ZMOGAUS CHROMOSOMU TYRIMO SPECIALUS METODAI: LYTINIS CHROMATINAS, F KUNELIAI, SIDABRO IMPREGNACIJA, FISH (FLUORESCENTINE IN SITU HIBRIDIZACIJA).

Lytinis chromatinas: (cia apie X chr.) ji galima tirti kiekviename zmogaus audinyje. Patogiausia jo ieskot burnos gleivines epitelio nuograndose ir daugiabranduoliuose leukocituose. Burnos epiteliniu lasteliu branduoliu periferijoje matyti ryskiai nusidazantys chromatino telkiniai – Baro kuneliai, o leukocituose – branduoliu isaugos. Ju galai esti sustoreje kaip bugno lazdeles. Lytinis chromatinas nustatomas greitai, bet apytiksliai. Pvz jei pas vyra randama X lytinio chromatino, tai nieko nepasako apie jo lytiniu chr. konstitucija, nes galimi XX, XXX, XXY ir kitokie kariotipo variantai. Dabar, kai galima istirti kariotipa, X lytinio chr. tyrimas prarado savo reiksme.

F kuneliai: tai yra Y lytinis chromatinas. Flourescuojanciais akridino dazais nudazytos chromosomos svyti UV sviesoje. Itin ryskiai fluorescuoja Y chr. ilgasis petys. Y chromatino tyrima galima naudoti kaip ekspres metoda Y chromosomai pamatyti, ty vyriskai lyciai nustatyti. F kuneliu skaicius atitinka Y chr. skaiciu lasteleje. Pacientu kuriu kariotipas 47, XYY, 30% lasteliu matomi 2 F kuneliai, 10-20% lasteliu – vienas F kunelis.

Sidabro impregnacija: ant opjektinio stiklo uzlasinamas 50% AgNO3 tirpalas ir uzdengiamas dengiamuoju stikleliu. Eksponuojama nuo keliu minuciu iki 24 valandu. Kartais preparatai apsvieciami stipria sviesa.  Ag impregnacija naudojama NOR (branduleliu organizatoriams), esantiems akrocentriniu chr. trumpuosiuose peciuose, dazyti. Chr. nusidazo geltona spalva, o ant akrocentriku trumpuju peciu nuseda tamsus (rudi ar juodi) taskai.   

FISH: molekulines DNR hibridizacijos ant citologiniu preparatu metodas. Pakelus temperatura, DNR „lydosi“ – atsiskiria viena nuo kitos DNR grandines, ir jos gali jungtis su homologines DNR komplementariomis grandinemis – sekomis arba su RNR. Si komplementariai jungiasi su ta grandine ir tik su ta vieta, nuo kurios si RNR buvo sintetinta, ty su ta vieta kur yra sios RNR genas. Taigi siuo metodu galima nustatyti ne tik chromosoma, bet ir chromosomos vieta, kur yra tiriamas genas. Metodas pavadintas FISH (angl. Flourescence in situ hybridization) nes naudojami molekuliniai zondai zymimi fluorescenciniais dazais.   

4. CHROMOSOMU ANOMALIJU DAZNIS NEATRINKTOJE NAUJAGIMIU POPULIACIJOJE. PAGRINDINIAI KLINIKINIAI SRAUTAI I KURIUOS PATENKA CHROMOSOMINIAI LIGONIAI.

Chr. anomaliju daznis neatrinktoje naujagimiu populiacijoje: didzioji dalis chr. anomaliju eliminuojamos ankstyvose embriogenezes stadijose. Taciau kai kurios, nesukelusios embrioletalaus poveikio lieka, ir gimsta defektyvus naujagimis. Kariotipu pakitimu populiacini daznuma galima nustatyti, masiskai tiriant naujagimiu chromosomas. Taciau dauguma chr. sindromu pasitaiko labai retai (1:10 000 naujagimiu ir reciau), o viena laboratorija tegali atlikti ne daugiau kaip keliolika tukstanciu kariotipu tyrimu. Taigi, norint susidaryti bendra vaizda reikia sudeti visus zinomus masinius naujagimu kariotipu tyrimus. Todel susidaro problemu: 1) sunku ivertinti kokia anomaliu kariotipu dali sudaro mozaikiniai (po apvaizinimo ivyke) variantai; 2) kadangi chr. dazomos diferenciniais metodais tik itarus chr. anomalija gali likti nepastebetos kai kurios subalansuotos chr. aberacijos; 3) kai tyrimu rezultatai labai skiriasi nuo kitu laboratoriu gautu rezultatu, duomenys laikomi nepatikimais; 4) kartais tiriama tik dalis naujagimiu, o duomenys ekstrapoliuojami i didesne populiacija. Apibendrinus tyrimu rezultatus, paaiskeja, kad chr. anomaliju pasitaiko nuo 0,47 iki 0,83% naujagimiu (vidutiniskai 0,61%). Kariotipo analize igalino nustatyti, kad lytiniu chr. pakitimai pasitaiko 0,23% naujagimiu.

Pagrindiniai klinikiniai srautai i kuriuos patenka chromosominiai ligoniai: pagal ju sukeltus simptomus chr. anomalijos skirstomos i tris mazdaug vienodo didumo grupes: 1) nesubalansuotos autosomu aberacijos, nustatomas 1,9 is 1000 naujagimiu. Anomalijos sukelia dauginius sklaidos trukumus, dauguma sirgs Patau, Edvardso arba Dauno sindromais; 2) subalansuotos autosomu aberacijos, nustatomos 1,94 is 1000 naujagimiu. Nesukelia fenotipo defektu, todel tik nedaugeli jas turinciu zmoniu istiria citogenetiskai (po to, kai jiems gimsta vaikas paveldejes nesubalansuota kariotipa); 3) lytiniu chr. aneuploidijos, nustatomos 2,3 is 1000 naujagimiu. Sios anomalijos pazeidzia beveik isimtinai generatyvine (ne anksciau kaip lytinio brendimo laikotarpiu) ir psichine (ne jaunesniems kaip mokyklinio amziaus vaikams) funkcija. Taciau apie 80% moteru, turinciu kariotipa 47, XXX, ir vyru, turinciu kariotipa 47, XYY, chr. anomalijos lieka nediagnozuotos, nes jie yra visai sveiki ir gimdo sveikus vaikus.    

5. ZMOGAUS LYTINIU CHROMOSOMU TRISOMIJOS, JU SUSIDARYMO MECHANIZMAI.

Zmogaus lytiniu chromosomu trisomijos: X chromosomos trisomija (47, XXX), Klainfelterio sindromas (47, XXY) ir Dzeikobso sindromas (47, XYY).

X chromosomos trisomija, kariotipas 47, XXX. Tokioms moterims budingi du Baro kuneliai. Gali pasitaikyti didesnio laipsnio polisomija (48, XXXX, 49, XXXXX). Gimstamumui motinos amzius itakos neturi. Genetiskai aktyvi tik viena X chromosoma. Fenotipas turetu buti normalus, taciau gali buti didesnis uz vidutini ugis, redukuotas TRC (abieju ranku papiliariniu liniju sk.), siek tiek atsilikusi psichine raida. Fizine branda normali, normalus lytiniai organai, normalus fertilumas. Negydoma. Gali gimdyti normalius vaikus. Susidarymo mechanizmas: vykstant ovogenezei ivyksta X chr. neissiskyrimas pirmoje ar antroje mejozeje.

Klainfelterio sindromas, kariotipas 47, XXY. Apie 60% ligoniu XX paveldi is motinos. Somatinese lastelese stebimas Baro kunelis. Dazniausiai gimsta vyresnio amziaus tevams. Iki lytinio brendimo is bendraamziu neissiskiria. Brendimo metu istysta. Neproporcingai ilgos kojos. Suaugusiu kapselis ir varpa normalus arba mazi, seklides lytinio brendimo metu nepadideja. Sumazejes lytinis potraukis. Psichine raida dazniausiai normali. Vaiku neturi, nes nevyksta spermatogeneze. Susidarymo mechanizmas tas pats.

Dzeikobso sindromas, kariotipas 47, XYY. Gali buti ir 48, XYYY, 49, XYYYY. Tevu amzius didesnis uz vidutini. Suauge fiziskai ir protiskai sveiki. Auksti. Kunas proporcingas. Taciau gali buti skeleto anomaliju, nesimetriskas veidas, idubusi krutine, budingas raumenu silpnumas. Lytinis gyvenimas normalus, bet vaiku susilaukia retai. Gali buti agresyvus, antisocialus, homoseksualus. Aktyvus, impulsyvus. Susidarymo mechanizmas: Y chromosomos neissiskyrimas mejozes metu.

Neissiskyrimas I anafazeje:
         XXXX                                                                                                                          XXYY
l                     m           l        m
XXXX             0                                     XXYY           0              I anafaze
l m     l m               l m  l m
XX   XX     0       0                               XY   XY     0       0          II anafaze

Neissiskyrimas II anafazeje:
                             XXXX                                                                                                                                   XXYY
  l           m                    l           m
   XX                 XX                                                                                         XX            YY            I anafaze
l m           l m                 l m  l m
XX    0         XX       0                        XX       0    YY      0         II anafaze


6. ZMOGAUS AUTOSOMU TRISOMIJOS. ZIGOTINE IR POZIGOTINE HETEROPLOIDIJA. EMBRIOLETALUS CHROMOSOMU DISBALANSAS.

Zmogaus autosomu trisomijos: Edvardso sindromas, Patau sindromas ir Dauno sindromas.

Edvardso sindromas: 18 chromosomos trisomija. Kariotipas 47, XX (XY) +18. Tiriamas citogenetiniu metodu. 75% ligoniu – mergaites, nes 47, XY+18 maziau gyvybingi. ♂ embrionai greiciau abortuoja. Sergantys mirsta pirmai gyvenimo metais. Gimsta dazniausiai vyresnems motinoms. Pasireiskia psichomotorines raidos sutrikimai, maza mase, skeleto, veido anomalijos, sirdies ydos. Apie 50% mirsta pirma savaite. Galima bandyti chirurgiskai taisyti vidaus organu anomalijas.

Patau sindromas: 13 chromosomos trisomija. Kariotipas 47, XX (XY)+13. ♂ ir ♀ serga vienodu dazniu. Dazniausiai gimsta vyresnems motinoms. Gimsta neisnesioti, mazai sveria, blogai susiformave, mikrocefalija, nesuauge gomurus ir lupos, sirdies ydos. Ryskus psichomotorinis atsilikimas. Sunkios anomalijos pazeidzia visas organu sistemas. Amzius matuojamas savaitemis.

Dauno sindromas: 21 chromosomos trisomija. Kariotipas 47, XX (XY)+21. Gali issivystyti del 21 chr. poros neissiskyrimo mejozes metu, arba del 21 chr. translokacijos ant 14 chromosomos. Mutacija gali vykti ir tevo ir motinos organizme, taciau pastebima ryski koreliacja tarp motinos amziaus ir ligos tikimybes. Kuo vyresne moteris gimdo, tuo senesne kiausialaste apvaisinama, ji gali buti labiau paveikta mutagenu, galimas chr. neissiskyrimas. Spermatozodai gaminasi nuolat, be to, sveiki spermatazoidai gyvybingesni. Ligoniams veliau uzauga momeneliai, jie veliau pradeda vaikscioti. Budinga maza galva, menulio veidas, istrizos akys, didelis liezuvis. Visi psichiskai atsilike. Daznos sirdies – kraujagysliu sistemos, virskinimo trakto anomalijos. Gyvenimo trukme mazeisne nei sveiko individo. Nezinoma kad 47, XY+21 turetu vaiku, nors lytiniai organai issivysto normaliai. Moteru yra gimdziusiu, vaikai gali gimti normalus.

Zigotine ir pozigotine heteroploidija: Zigotine heteroploidija yra kai susilieja defektuotos gametos (arba viena defektuota gameta su sveika gameta). Galimos ivairios chromosomu aberacijos, ligos. Pozigotine heteroploidija yra kai zigotos somatinese lastelese vykstant mitozei ivyksta chromosomu neissiskyrimas, nors gametos galejo buti abi normalios. Daznai pasireiskia paveikus mutagenams motinos kune (alkoholis, nikotinas, narkotikai).   

Embrioletalus chromosomu disbalansas: kai susidaro tokie chromosomu rinkiniai kurie sukelia embriono zuti, ty savaimini aborta. Polipoidija – kai chromosomu skaicius skiriasi istisu rinkiniu ( kariotipas 69, XYY (XXX) (XXY). Aneuploidija – kai chr. skaicius padaugeja ar pamazeja viena (ar keliomis) chromosomomis. Dauguma chromosomu aberaciju yra embrioletalios.  

7. TRANSLOKACINIS DAUNO SINDROMAS. PAVELDEJIMO SCHEMA.

Translokacinis Dauno sindromas: 21 chromosomos trisomija. Kariotipas 47, XX (XY)+21. Gali issivystyti del 21 chr. poros neissiskyrimo mejozes metu, arba del 21 chr. translokacijos ant 14 chromosomos. Ivykus 21 chromosomos translokacijai i 14 chromosoma asmuo yra normalus, translokacija subalansuota, kariotipas nepasikeicia. Taciau padideja galimybe sulaukti defektyviu palikuoniu. Jei translokacija ivyksta ant homologines chromosomos (21 chr. translokuojasi ant kitos 21 chromosomos) visi palikuonys bus daunai.  Mutacija gali vykti ir tevo ir motinos organizme, taciau pastebima ryski koreliacja tarp motinos amziaus ir ligos tikimybes. Kuo vyresne moteris gimdo, tuo senesne kiausialaste apvaisinama, ji gali buti labiau paveikta mutagenu, galimas chr. neissiskyrimas. Spermatozodai gaminasi nuolat, be to, sveiki spermatazoidai gyvybingesni. Ligoniams veliau uzauga momeneliai, jie veliau pradeda vaikscioti. Budinga maza galva, menulio veidas, istrizos akys, didelis liezuvis. Visi psichiskai atsilike. Daznos sirdies – kraujagysliu sistemos, virskinimo trakto anomalijos. Gyvenimo trukme mazeisne nei sveiko individo. Nezinoma kad 47, XY+21 turetu vaiku, nors lytiniai organai issivysto normaliai. Moteru yra gimdziusiu, vaikai gali gimti normalus.

Paveldejimo schema:


8. ZMOGAUS AUTOSOMU DELECIJU SINDROMAI. LEZENO (KATES KNIAUKIMO) SINDROMAS. GENOMO IMPRINTINGAS: PRADER-WILLI IR ANGELMANO SINDROMAI (15q PARACENTROMERINE DELECIJA).

Zmogaus autosomu deleciju sindromai: tai yra sindromai pasireiskiantys, kai dalis autosomos buna prarasta. Dauguma embrionu su autosomu delecijoms abortuoja. Net labai nedidele aberacija gali sukelti sunkius padarinius.  

Kates kniaukimo sindromas: 5 autosomos trumpojo peties p delecija. Kariotipas 46, XX (XY) 5p-. Mergaiciu gimsta 2,5 karto daugiau, bet jos anksciau mirsta, todel vyresniu tarpe daugiau vyru. Nuo tevu amziaus nepriklauso. Gimsta laiku ar neisnesioti. Stebimos daugyvines anomalijos: mikrocefalija, raumenu, griauciu anomalijos, sirdies, inkstu sutrikimai, suletejusi psichomotorine raida. Budingas apvalus veidas, placiai issidesciusios akys, mazos ausys, nerisli sneka. Riksmas kaip kates kniaukimas – oktava aukstesnis uz iprasta. 1,5 – 2 metu vaikams kniaukimo nebelieka. Dazniausiai mirsta vaikysteje.

Genomo imprintingas: tai tarsi pazymejimas nurodantis ar chromosoma buvo paveldeta is tevo ar is motinos. Pats zymejimas DNR nukleotidu sekos nekeicia. Genominis imprintingas yra reikalingas todel, kad homologiniu chromosou poroje viena chr. turi buti is tevo, kita is mamos. Jeigu abi homologines chr. yra paveldimos is vieno tevo embrionai dazniausiai buna negyvybingi. Imprintingas budingas eukariotams kurie dauginasi lytiniu budu, ty vyksta gametu susiliejimas. Genomo imprintingo pavyzdys yra Angelmano ir Prader-Willi sindromai. Angelmano sindromas yra paveldimas is motinos del15 chr ilgojo peties delecijos. Taciau jei 15 chr. ilgojo peties delecija ivyko is tevo puses paveldimas sindromas yra Prader-Willi. Sios ligos pasireiskia skirtingais simptomais: Angelmanu sergantys yra jautresni karsciui, zavisi vandeniu, placios sypsenos, zodines kalbos sutrikimas, laikinas raidos sutrikimas ankstyvoje vaikysteje, protinis atsilikimas. Prader-Willi serganciuju pagrindinis simptomas – impulsyvus valgymas, todel ligoniai yra nutuke, dar pasireiskia atsilikimas moksle. 

9. DERMATOGLIFIKA KAIP PAGALBINIS ZMOGAUS TYRIMO METODAS.

Dermatoglifikos ir palmoskopijos metodas remiasi delnu ir padu lenkiamuju rauksliu bei papiliariniu (speneliniu) liniju tyrimu. Dermatoglifinis rastas yra individualus ir islieka visam zmogaus gyvenimui. Pagrindinis dermatoglifikos elementas yra triradiusas (delta) – taskas, primenantis triju spinduliu zvaigzde, kur labiausiai suarteja papiliarines linijos. Delne iprastai matomi penki triradiusai – ties II, III, IV, V pirstais ir proksimaliniame delno gale. Pirstu paglavelese skiraimi tris papiliariniu liniju rastu tipai: kilpa, ratas ir lankas. Lankas – atviras rastas be triradiuso; kilpa – is vienos puses uzdaras rastas su vienu triradiusu; ratas – uzdaras rastas su dviem triradiusais. Jei kilpa yra i V pirsto puse nuo triradiuso, ji vadinama ulnine, jei i I pirsto puse – radialine. Kartais buna ir sudetingesniu rastu. Kiekybiskai dermatoglifinio rasto vertinimas atliekamas skaiciuojant papiliariniu liniju kieki tarp triradiuso ir rasto centro (RC – Ridge Count). Taip pat naudojamas ir bendras abieju ranku papiliariniu liniju skacius (TRC – Total Ridge Count). Moterims jis vidutiniskai lygus 100-120, o vyramas 120-140. Sis metodas naudojamas nustatant dvyniu zigotiskuma, identifikuojant asmeni kriminalistikoje arba nustatant tevyste. Jei is 10 poru homologiniu pirstu dvyniai turi ne maziau kaip 7 panasius rastus jie laikomi monozigotiniais. Dar dermatoglifika naudojama diagnozuojant kai kurias genu arba genomu mutacijas (Dauno liga, Klainfelterio, Ternerio sindromai). Delne skiriamos 3 pagrindines lenkiamosios rauksles: didziojo pirsto, skersine ir izambine. Delno virsuje (ties pirstu pradzia) yra triradiusai a, b, c ir d, o delno apacioje yra pagrindinis triradiusas t. Sujungus triradiusus a, d ir t gaunamas pagrindinis delno kampas, kuris normoje nedidesnis 57 laipsniams. Apie igimta genetini susirgima gali liudyti delno kampas didesnis uz 60 laipsiu ir kilpos IV ir V pirstu pagalvelese.

10. BIOCHEMINIS TYRIMO METODAS ZMOGAUS GENETIKOJE. FENILKETONURIJA, JOS LABARATORINE DIAGNOSTIKA.

Biocheminis tyrimo metodas zmogaus genetikoje: genetinemis ligomis serganciu asmenu paveldimuju strukturu pakitimai vyksta molekuliniame lygyje.genetines ligos diagnozuojamos biocheminiais metodais: nutruksta atitinkamu fermentu sinteze, kaupiasi defektyvys substratai, nerandma tam tikru medziagu.

FKU, jos laboratorine diagnostika: amino rugsties fenilalanino apykaitos sutrikimas. Fen.- nepakeiciama amino rugstis, ieina i ivairiu baltymu sudeti. Fen. paros doze yra apie 30mg/1 kg svorio. Vykstant normaliai audiniu apykaitai fenilalaninas fermentu skaidomas i tirozina. Tirozinas reikalingas melanino, neuromediatoriu gamybai. Dar fen. per eile etapu gali buti suskaidomas i CO2 ir H2O. Del fermento defekto organizme pradeda kauptis fenilalaninas. Nenormalus skilimo produktai (fenilacto, fenilpieno rugstys) patenka i krauja ir sutrikdo CNS vystymasi. Sutrinka normalus neuromediatoriu gamybos procesas. Vystosi silpnaprotyste. Sutrinka pigmento gamyba. Kudikiai gimsta normalus, nes nestumo metu fen. perteklius pereina per placenta. Ligos pozymiai isryskeja pirmais gyvenimo menesiais. Vaikas vangus, budingas astrus slapimo kvapas. Genas yra 12 chr. q petyje. Visi gime naujagimiai (sviestas sviestuotas) testuojami tiriant krauja. Kitas budas diagnozuoti – ant vystyklu uzlasinti Felingo reagento. Ligos atveju slapimas nusidazo zalsvai. Gydymas – dieta. Grieztai ribojamas baltymu su fen. patekimas i organizma. Kuo anksciau pradedamas gydymas tuo normalesnis uzauga vaikas. Dieta reikalinga iki 8-10 metu. Veliai medziagu apykaita persitvarko, galima duoti normalu maista.   

11. DAUGIAVEIKSNIS PAVELDEJIMAS. DVYNIU METODAS ZMOGAUS GENETIKOJE.

Daugiaveiksnis paveldejimas: daugelio nealeliniu genu veikla sumuojasi. Tai gali pasireiksti dviem budais: 1) pozymis yra daugelio darniai, bet savarankiskai veikianciu vieno paskui kita genu veiklos rezultatas (budinga komplementariems genams); 2) pozymis yra genu veiklos paprasto sumavimosi rezultatas (budinga poligenams). Komplementariems genams bendra tai, kad hibriduose del dvieju ar daugiau nealeliniu genu saveikos pasireiskia naujas fenotipas, nebudingas atskirai veikiantiems (dazniausiai mutantiniams) genams. Komplementarios saveikos budu paveldima labai daug pozymiu. Pvz, dvieju kurcnebyliu santuokoje gali gimti normalus vaikas. Nealeliniai genai, kurie lemia ta pati pozymi ir kuriu veikimas sumuojasi, vadinami poligenais, o sumavimosi reiskinys – polimerija. Pvz. odos spalva.

Dvyniu metodas zmogaus genetikoje: leidzia nustatyti genetiniu ir aplinkos veiksniu itaka tam tikriems zmogaus pozymiams arba susirgimais. Dvyniu tipui (monozigotiniai, dizigotiniai) nustatyti naudojami keli skirtingi metodai: 1) polisimptominis metodas: dvyniai lyginami pagal isorinius pozymius, pvz pagal akiu, nosies, ausu forma, plauku spalva. Sis metodas paprastas taciau maziausiai tikslus; 2) biocheminis metodas: kraujo grupiu, kraujo baltymu tyrimai, kita biochemine analize. Monozigotiniu dvyniu tyrimu duomenys sutampa; 3) imunologinis metodas: antigenu ir atmetimo reakciju analize. Monozigotinems poroms audiniu transplantacija yra sekminga. (oj, mes tik apkeisim jusu inkstus. jei jusu neistiks imunitetinis sokas ir jus nenumirsite, tai jus monozigotiniai dvyniai... pretenziju nepriimame =D). Dvyniu poros laikomos konkordantinemis pagal tam tikra tyrimui pasirinkta pozymi, jei abu poros nariai turi si pozymi. Jei pozymi turi tik vienas is dvyniu – jie diskordantiniai. Konkordiskumo laipsnis lygus konkordisku dvyniu is visu dvyniu santykiui. Nustacius konkordiskumo laipsni, tiriama aplinkos ir paveldimumo itaka. Visus pozymiu skirtumus tarp monozigotiniu dvyniu nulemia aplinkos salygos. Dizigotiniai dvyniai turi 50% bendru genu. Ju pozymiu skirtumus nulemia genotipai.  

12. POPULIACINIS-STATISTINIS TYRIMO METODAS ZMOGAUS GENETIKOJE. IZOLIATAI. GENU DREIFAS. PROTEVIO EFEKTAS.

Populiacinis-statistinis tyrimo metodas zmogaus genetikoje: naudojamas tiriant: 1) paveldimu ligu bei jas lemianciu genu paplitima ir daznius ivairiose zmoniu populiacijose (genai gali buti paplite visur, pvz. daltonizmas, ir paplite tam tikrose teritorijose, pvz. siklemija afrikoje; 2) mutaciju desningumus; 3) paveldimumo ir aplinkos veiksniu vaidmeni genetiniu ligu atsiradimui; 4) paveldimumo ir aplinkos veiksniu itaka zmogaus fenotipiniam polimorfizmui. Galima apskaiciuoti heterozigotu, homozigotu (dominantiniu ir recesyviniu) dazni populiacijoje remiantis Hardzio-Vainbergo desniu. Pagal si desni dominantiniu ir recesyviniu genu daznis populiacijoje yra pastovus dydis. Genotipu dazniu suma taip pat pastovus dydis. Taciau sis desnis taikomas idealiai populiacijai. Tokioje populiacijoje yra daug individu, vyksta laisvas kryzminimasis, ner atrankos, nevyksta mutacijos ir migracijos.

Izoliatai: tai yra populiacijos atskirtos nuo kitu populiaciju. Tai yra maza santuokos parteniu grupe. Vadinasi santuokos vyksta tarp artimu giminiu ir pasireiskia recesyviniai pozymiai. 

Genu dreifas: aleliu daznio populiacijoje pasikeitimas del migraciju, mutaciju, selektyvaus kryzminimosi.

Protevio efektas: dar vadinamas „butelio kaklelio“ efektu. Siuo atveju populiacijos genofonde pasilieka vos keli genotipai, nerepresantatyvus buvusiai populiacijai.

13. ALELIU DAZNIS POPULIACIJOJE. HARDZIO-VEINBERGO DESNIS.

Hardzio-Veinbergo desnis teigia, kad aleliu daznis genofonde, apskaiciuojamas pagal (p+q) ² = p² + 2pq + q² = 1 lygti, nesikeis kitose lytiskai besidauginancios populiacijos kartose, kol bus islaikomos sios 5 salygos: 1)nevyks mutacijos: aleliu pokyciu nera, arba vienos krypties pokycius atsveria kitos krypties pokyciai; 2) nebus genu migracijos: aleliu migracija i populiacija arba is jos nepastebima; 3) poravimasis vyks atsitiktinai; 4) nebus genu dreifo; 5) nevyks atranka, ty atrankos jega nepalaiko vieno genotipo labia uz kitus. Taciau sios salygos igyvendinamos labai retai, arba isvis neigyvendinamos. Aleliu daznis populiacijos genofonde keiciasi is vienos kartos i kita. Taip vyksta evoliucija. Hardzio-Veinbergo desnio deka galima pastebeti vykstant evoliucija, nes jis nusako evoliucija sukeliancius faktorius (tuos kurie pazeidzia tas 5 salygas). Evoliucija galima itarti radus nukrypimus nuo H-V aleliu dazniu pusiausvyros populiacijos genofonde. Aleliu dazniu pokyciai lemia fenotipu dazniu pakitimus.  

14. GENEALOGINE AUTOSOMINIO DOMINANTINIO PAVELDEJIMO ANALIZE. NEVISISKAS GENO PENETRANTISKUMAS IR NEVIENODA POZYMIO EKSPRESIJA.

Genealogine autosominio dominantinio paveldejimo analize: pozymi paveldi apytikriai vienodas kiekis vyru ir moteru. Pozymi perduoda palikuonims tiek vyras, tiek moteris vienodai. Pozymi gali salygoti tiek viena, tiek kelios poros genu (monogeninis ir poligeninis paveldejimai). Monogeninio paveldejimo atveju remiamasi I r II Mendelio desniais. Jei palikuoniu skaicius pakankamas, pozymis pasireiskia kiekvienoje kartoje, bet jei pozymio neturi tevai, jo netures ir vaikai. Taciau jei probandas yra mutantas, jis gali gimti pozymio neturintiems tevams. Todel galima manyti, jog pozymis yra dominantinis. Dominantiniai homozigotai fenotipiskai nuo heterozigotu nesiskiria. Taciau zmogaus paveldimu ligu atveju galimas kitoks pasireiskimas del genu ekspresyvumo skirtumo – heterozigotai nuo dominantiniu homozigotu skiriasi lengvesne ligos forma. Paveldimu pozymiu pvz. yra desniarankiskumas, gebejimas susukti liezuvi, polidaktilija, brachidaktilija ir tt.

Penetrantiskumas: tai procentais isreiskiamas daznis, kuriuo genas pasireiskia fenotipe, kai yra genotipas, butinas pozymiui issivystyti. Jei genas visada pasireiks fenotipe, jo penetrantiskumas – 100%. Taciau daugumai genu budingas mazesnis nei 100% penetrantiskumas. Pvz. sizofrenijos genas turi 70-80% penetrantiskuma, kraujo grupiu penetrantiskumas – 100%, lytis nera 100% penetrantiska. Penetrantiskumas rodo, jog tarp genotipo ir fenotipo nera tiesiogines koreliacijos.

Ekspresyvumas: geno/genotipo lemiamo pozymio intensyvumas. Ekspresyvumo skirtumai nustatyti kiskio lupai, vilko gomuriui, medziagu apykaitos sutrikimams, nervu ligoms. Fenotipas gali maskuoti genotipa. Taip susidaro salygos genui plisti populiacijoje nepriklausomai nuo gamtines atrankos. Paveldejimui pakites fenotipas neturi itakos, nes paveldejimas vyksta pagal genotipa. Paveldimas ne pats pozymis, o potencialios galimybes tam pozymiui pasireiksti. Daugelis aplinkybiu (isorines salygos, kiti genai) salygoja ar jos realizuosis ar ne.

15. GENEALOGINE AUTOSOMINIO RECESYVINIO PAVELDEJIMO ANALIZE. POZYMIO PAVELDEJIMO RIZIKA GIMINIU SANTUOKOJE.

Genealogine autosominio recesyvinio paveldejimo analize: pozymis salygojamas recesyvino alelio. Tipiski paveldejimo pozymiai pasireiskia esant pakankamam palikuoniu skaiciui. Pozymis nebutinai pasireiks kiekvienoje kartoje. Fenotipiskai pasireiskia tik recesyviniams homozigotams. Jei abu tevai heterozigotai tikimybe, kad palikuonis sirgs – ¼. Pozymio pasireiskimas nepriklauso nuo tevu lyties ar palikuoniu lyties. Heterozigotai nesiskiria nuo dominantiniu homozigotu. Pozymio paveldejimo tikimybe gali mazinti nedidelis penetrantiskumas. Jei pozymius lemia keliu lokusu recesyviniai genai, recesyviniams homozigotams gali gimti sveiki vaikai. Paveldimu pozymiu pvz. yra siauros akys, albinizmas, 5 normalus pirstai, kurcnebylumas, FKU.





Pozymio paveldejimo rizika giminiu santuokoje:
Giminystes laipsnis
Bendru genu dalis (pozymio paveldejimo rizika)
Tevai, vaikai, sibas
½
Seneliai, vaikaiciai, dede, teta
¼
Pusiausibas (pusbrolis, pussesere, netikri broliai ir seserys)
1/8

Pusiausibsu vaikai
1/16
    

16. RECESYVINIS PAVELDEJIMAS, SUSIJES SU X CHROMOSOMA. POZYMIAI, APRIBOTI LYTIES. POZYMIAI, KONTROLIUOJAMI LYTIES.

Recesyvinis paveldejmas susijes su X chromosoma: pozymis salygojamas recesyvinio alelio esancio X chromosomoje. Pozymis daugiau budingas vyrams (pas moteris vienas X buna inaktyvuojamas, tad joms su X chromosoma susije pozymiai pasireiskia tik tada jei jos yra tam pozymiui homozigotes). Sunus nepaveldi pozymio is tevo. Sveiku homozigotiniu moteru ir serganciu vyru santuokoje visi palikuonys, nesvarbu kokios lyties, bus sveiki. Heterozigotems motinoms tikimybe pagimdyti sunu su pozymiu yra 50%.

Pozymiai apriboti lyties: tai yra lyties issivystymas, ty, nepriklausomai nuo X chromosomu, individas su Y bus ♂. Y chromosomoje yra TDF lokusas, del kurio nediferencijuotos gonados vystosi i seklides, o ne i kiausides. Jei Y chromosomoje sio geno nera, XY individas bus ♀. TDF lokusas gali translokuotis i X chromosoma, tada XX gali buti ♂. Y chr. yra genu vadinamu holandriniais – tai genai kurie neturi homologo X chromosomoje, moterys siu genu nepaveldi. Tai yra AZF genas kuris lemia spermatogeneze, taip pat genai kurie lemia Y antigena, hipertrichora. X chromosomoje yra genu kuriu nera Y chromosomoje. Ju pasireiskimas priklauso nuo to ar jie yra ♂ ar ♀ lytyje.

Pozymiai kontroliuojami lyties: ne visi genai kurie skirtingai pasireiskia ♀ ir ♂, yra susije su lytinemis chromosomomis. Yra nemazai genu, kurie lokalizuojami autosomose is apsprendzia lytinius pozymius. Pvz. genai, salygojantys varpos, maksties, gimdos augima yra autosomose, bet ju fenotipine israiska skiriasi. Siu genu aktyvuma veikia lytiniai hormonai. Moteru lytiniai hormonai geno veikima slopina, o vyriski – skatina.   Tokie genai paveldimi ir ♀ ir ♂ vienodai, bet pasireiskia tik vienos lyties individuose. Priklausantys nuo lyties pozymiai – kuomet fenotipinis pasireiskimas itakojamas lytimi, bet abieju lyciu heterozigotuose alelio dominavimas skirtingas.    

17.NEVISISKAS DOMINAVIMAS. PJAUTUVINE MAZAKRAUJYSTE: MOLEKULINIS MECHANIZMAS, PAPLITIMAS.

Nevisiskas dominavimas: kai autosomines dominantines ligos paveldejime heterozigotai skiriasi nuo dominantiniu homozigotu lengvesne ligos (ar siaip pozymio pasireiskimo) forma. Heterozigote gaminamo produkto kiekis mazesnis palyginus su dominantiniu homozigotu, bet didesnis palyginus su recesyviniu homozigotu.

Pjautuvine anemija nulemia taskines genu mutacijos, kuomet, vienam nukleotidui pasikeitus vietoj glutamino rugsties inesamas valinas. Del to pakinta hemoglobino fizikochemines savybes. Jis tampa maziau tirpus, agreguojasi, sudaro skaidulas. Eritrocitai tampa pjautuvo formos, surisa mazai O2, uzstringa kraujo induose. Sutrinka audiniu aprupinimas krauju (ir deguonimi), vystosi mazakraujyste. Genas 11p. Budingas nevisiskas dominavimas. Heterozigotuose aptinkamas ir normalus ir patogeninis hemaglobinas. Eritrocitai igyja pjautuvo forma pateke i aplinka, kurioje mazai deguonies. Jei salygos normalios, heterozigotai neserga. Homozigotu visi eritrocitai pjautuvo formos, jie mirsta iki 2-5 metu. Toks letalinis genas teoriskai turetu buti eliminuotas is populiacijos naturaliaja atranka. Taciau Afrikoje heterozigotu yra apie 20-40%. Pakitusi HbS grandine daro zmogu atsparesini maliarijai. Kai maliarinis plazmodijus patenka i eritrocita, sis tampa pjautuviskas, plazmodijus zuva. Taip islaikomas subalansuotas polimorfizmas, kai egzistuoja ir toks, ir toks hemoglobinas.  

18. PRENATALI DIAGNOSTIKA: AMNIOCENTEZE, CHORIONO GAURELIU BIOPSIJA.

Prenatali diagnostika: metodas nustatyti paveldimaja liga iki gimimo, tiriant kariotipa, reakciju poslinki.

Amniocenteze: geriausia atlikti 15-16 savaite. Saugus, tikslus metodas. Galima atlikti X, Y chromatino tyrimus, nustatyti lyti, tokias ligas kaip hemofilija, Diuseno raumenu distrofija, ir tt. Procesas gana ilgas. Stebint mikroskopu, punkcija paimama 15ml vaisiaus vandenu su lastelemis, atsisluoksniavusiomis nuo vaisiaus. Jos tiriamos citologiskai, biochemiskai. Kariotipui nustatyti reikia besidalijanciu lasteliu, o nuo vaisiaus atsisluoksniavusios lasteles nesidalija, todel jas reikia paauginti terpeje. Tai gali uztrukti 2-4 savaites. (Gali praeiti saugus laikas daryti aborta, bet Sinkui to sakyt negalima, nes mus bala J).

Choriono gaureliu biopsija: atliekama nuo 5 savaites. Stebint ultragarsu, pro maksti tarp gimdos sieneles ir choriono ivedamas kateteris. Juo issiurbiama 5-10mg audiniu. Biopsijos medziagai nereikia dauginti lasteliu kulturoje, nes yra besidalijanciu lasteliu. Atliekamas kariotipo, biochemine analize, nustatomas gyvybingumas, daugelis paveldimu ligu. (Privalumas: esant prastiems rezultatams, dar nevelu daryti aborta. Velgi, Sinkui sakyti negalima).

19. FARMAKOGENETIKA: DOMINANTINE P. AFRIKOS PORFIRIJA, X-RECESYVINIS G6PD (GLIUKOZES-6-FOSFATDEHIDROGENAZES) DEFEKTAS, AUTOSOMINIS RECESYVINIS JAUTRUMAS IZONIAZIDUI.

Farmakogenetika: paveldimu faktoriu reiksme reakcijai i medikamentus bei mechanizmus salygojancius anomaline mutantinio organizmo reakcija.

Dominantine P. Afrikos porfirija: porfino apykaitos sutrikimai. Sutrikus porfino apykaita sutrinka hemo (sudaro hemoglobina, suteikia jam spalva) gamyba, sis pradeda kauptis odoje (nudazo ja violetiniu atspalviu), kaupiasi ant dantu ir pirstu nagu, yra pasalinamas su slapimu. Jautrumas saules spinduliams, odos nekroze. Drastiskos reakcijos i barbituarus, siaubingi skausmai.

X-recesyvinis G6PD defektas: vyrai kuriu lastelese sintetinama mazai G6PD, serga liga, vadinama fabizmu. Ligos pavadinimas rodo, kad tokie zmones gali apsinuodytu nesunokusiomis pupomis (vicia faba). Jiems pavojinga net vaikscioti po zydinciu pupu lauka, taip pat gali pakenkti kai kurie vaistai: sulfamidiniai preparatai, barbituratai. Nesintetinantiems fermento zmonems visi sie veiksniai sukelia mazakraujyste. 

Autosominis recesyvinis jautrumas izoniazidui: izoniazidas naudojamas turberkuliozei gydyti. Gali sukelti drastiskas imuniteto reakcijas zmonems su recesyviniu pozymiu siam vaistui. Dazniau pasitaiko Azijos salyse. Tai yra kepenu fermento  suardancio izoniazodio defektas paveldimas kaip recesyvinis pozymis.

20. POTENCIALUS MUTAGENAI ZMOGUI. MUTAGENISKUMO IVERTINIMO METODAI.
Potencialus mutagenai zmogui: Mutagenai – veiksniai, galintys pakeisti DNR struktura. Jie yra triju tipu: fizikiniai, cheminiai ir biologiniai. Fiziniai mutagenai - radioaktyvus spinduliavimas, elektro magnetines bangos, UV spinduliai. Mutageninis ju poveikis yra tiesiog proporcingas ju dozei. Fizine mutageneze taikoma siekiant gauti produktyvesnes bakteriju rases. Didziausiu mutageniniu poveikiu pasizymi chemine mutageneze. Aplinkos mutagenu saltinis - zemes ir misku ukio cheminizavimas. Reiksmingiausi - pesticidai t.p. nitro junginiai, kuriu daug i dirva patenka su trasom, o po to i vandeni ir i zmogaus organizma. Kitas saltinis - chemines pramones atliekos. Plinta alkilinanciu mutagenu grupe (tai tarpinis ivairių technologiju produktas). Del didelio aktyvumo sie mutagenai vadinami super mutagenais. Silpnesnio mutageniskumo yra kofeinas, nikotinas, vaistai. Mutageniskumu pasizymi ivairus konservantai esantys musu maiste. Biologiniai mutagenai - tai virusai, kurie pateke i lastele indukuoja joje mutacijas.
Mutageniskumo ivertinimo metodai: pirmiausia reikia vienpusiskai ivertinti veiksni, arba veiksniu „kokteili“. Butina nustatyti mutagenini, rekombinogenini, ir teratogenini poveiki, be to, mutagenini diferencijuotai pagal mutaciju tipus: genomo, chromosomu, genu. Skirtumai pasireiskia net tarp to paities organizmo skirtingai diferencijuotu lasteliu, audiniu. Mutageniskuma ivertinti naudojami Salmonella, Escherichia bandiniai, nes jie per trumpa laika suteikia ziniu apie galima genotoksiskuma. Taip pat vertinami chromosomu aberaciju tyrimai zmogaus limfcituose arba ivairiose eksperimentiniu gyvuliuku lastelese, nes jose galima tirti ir genu mutacijas. Tos pacios lasteles jautrumas mutagenui irgi kinta. Tai labai smulkiai nustatyta zinduoliu lytinems lastelems.  

21. ZMOGAUS GENOMO DYDIS, GENU SKAICIUS. KODUOJANCIOS IR NEKODUOJANCIOS DNR SEKOS. INTRONAI IR EGZONAI.

Zmogaus genomo dydis, genu skaicius:

Koduojancios ir nekoduojancios DNR sekos: nekoduojanciai DNR priskiriami speiseriai ir intronai. Tai yra DNR sekos kurios neturi genetines informacijos. Speiseriai skiria pavienius genus ar genu grupes. Speiseriai kurie skiria viena globino gena nuo kito, netranskribuojami, o speiseriai kirie skiria rRNR genus transkribuojami, o procesingo metu pasalinami. Ju gali ir nebuti. Mitochondrijos genome speiseriu vaidmeni atlieka tRNR. Taciau nuo speiseriu gali priklausyti genu veikla. Intronai – nukleotidu sekos (po tris nukeotidus) eukariotu genu viduje. Jie po transkripcijos pasalinami. Pasalinant skirtingus intronus gaunami skirtingi produktai. Prie nekoduojancios DNR  dar priskiriamos ir reguliacines sekos. Jos priima signalus, salygoja salia esanciu genu transkripcija. Dazniausiai buna geno priekyje. Koduojanti DNR – genetiskai informatyvios sritys, uzkoduota baltymu ir RNR struktura. Koduojanciu sticiu genai gali buti unikalieji ir kartotiniai. Unikalios sritys yra tos kuriu sekos genome nesikartoja. Jos salygoja fermentus, strukturinius baltymus kuriu reikia labai nedaug, ir pakanka vienos matricos. Pasikartojancys genai – DNR sritys kurios kartojasi nuo keliu iki keliasdesimt kartu ir daugiau. Kuo daugiau genas pasikartoja, tuo daugiau transkribuojama RNR, ir tuo daugiau pagaminama produkto. Tai genai kurie salygoja svarbius produktus. Ivykus vieno tokio geno mutacijai produkto gamyba nenutruksta, nes lieka daugelis kitu tokiu pat genu. Egzonai – ta geno dalis kuri po transkripcijos nebuna pasalinama ir buna transliuojama i amino rugstis (sudaro baltyma).

22. ZMOGAUS GENOMO BIBLIOTEKA. RESTRIKTAZES, LIGAZES, VEKTORIAI, YAC (MIELIU DIRBTINE CHROMOSOMA). ZMOGAUS GENU KLONAVIMAS. DNR ZONDAI.

Zmogaus genomo biblioteka: klonuotu genmo fragmentu rinkinys, atstovaujantis visam genomui. Zmogaus genomo bibliotekai pirmenybe teikiama YAC, del daugelio priezasciu, kuriu viena – didesnis talpis. DNR fragmentai klonuojami i YAC vektorius, ir jie buna saugomi uzsaldyti. Norint ivesti tvarka bibliotekoje, klonuotu genu seka nustatoma pagal tai, kurie genai dengia vienas kita.

Restriktazes: fermentai aptikti bakterijose. Ju pagalba bakterija ginasi nuo bakteriofagu. Siam isiskverbus i lastele restriktaze jo DNR sukarpo i atskiras dalis. Sie fermentai atpazysta specifines DNR sritis – polindromines sritis. Sios sritys skaitomos vienodai abiem kryptim. Ikirpus vietas gaunami du nesimetriniai bet komplementiniai galai. Galai gali buti „lipnus“ ir „buki“. Lipnus galai yra DNR molekules, kuriu vienoje grandineje yra nesuporuoti nukleotidu galai.  Buki galai yra kai nesuporuotu nukleotidu nera. 

Ligazes: sujungia DNR fragmentus. Pvz vykstant replikacijai ligaze sujungia veluojanciosios grandies Okazaki fragmentus. Taip pat sujungia restriktazes sukarpyta DNR.

Vektoriai: transpozonu tipo judrieji elementai (McClintoc 7 Bendrosios Gen. klausimas), kurie yra dirbtinai sukonstruojami is dvieju judriuju elementu. Sios konstrukcijos naudojamos genu inzinierijoje.

Zmogaus genu klonavimas: zmogaus genai klonuojami norint defektyvu gena pakeisti normaliu. Yra 4 genu klonavimo budai. 1) tiesiogine genu sinteze. Genas sintetinamas cheminiais metodais. Is pradziu gautos nedideles atkapeles, po to sujungtos. Genas bus neveiklus jei nesusintetinamos geno reguliacines sekos. 2) isskyrimas transdukcijos budu. Tam panaudojami virusai kurie atlieka specifine DNR transdukcija (prisitvirtina specifineje vietoje). Sis metodas ribotas nes sunku rasti tinkamus virusus. 3) biologine geno sinteze panaudojant fermenta atvirkstine transkriptaze. Sis fermentas pagal RNR sintezuoja DNR grandi. Taip pirmiausiai buvo gautas zmogaus hemoglobino genas. 4) dirbtinis hibridiniu molekuliu gavimas. Hibridines DNR molekules gaunamos sujungiant dvieju virusu grandis i viena. Segmentai sujungiami lipniais galais. DNR transferaze sujungia dvi grandines i viena. Veliau DNR fragmentams sujungti panaudojami fermentai restriktazes. Sie fermentai atpazysta specifines DNR sritis – polindromines sritis. Sios sritys skaitomos vienodai abiem kryptim. Ikirpus vietas gaunami du nesimetriniai bet komplementiniai galai. Tada galima sujungti fragmentus. Taip galima gauti kokia nori DNR molekule, koki nori gena.   

DNR zondai: zinomi viengrandes DNR fragmentai. Naudojami ieskant komplementaraus DNR fragmento.

23. RESTRIKCINIU FRAGMENTU ILGIO POLIMORFIZMAS (RFIP). SOUTHERN-BLOTINGAS. RESTRIKCINIAI GENOLAPIAI.

RFIP: restrikcijos fragmentu dydis patikrinamas elektroforezes metu. Sis metodas tinkamas naudoti, jei mutacija sukuria ar panaikina restrikcijos fermento „kirpimo“ vieta.

Southern-blotingas: (angl. Blot – deme, sutepti (ypac rasalu), nudziovinti sugeriamuoju popieriumi). Pastaroji prasme labiausiai atitinka esme, nes restriktazemis suskaidyti viengrandziai DNR fragmentai po elektroforezes talpinami ant nitroceliuliozes arba ant nailono filtro. Ten jie surisami pagal ju santykine padeti. Fragmentai pazystami radioaktyviuoju arba kitokiu budu zymetuoju zondu, su kuriuo jie komplementariai jungiasi.  

Restrikciniai genolapiai: chromosomose linijiskai kartografuojami ne genai, o restriktaziu pazinimo vietos. DNR skaidoma ivairiomis restriktazemis. Pagrindinis uzdavinys surikiuoti teisinga seka fragmentus, nustatomus elektroforeziskai. Tai atliekama ivairiais budais. Dazniausiai pirmiausia DNR suskaidoma i stambius segmentus dviem skirtingom restriktazemis, paskui gauti segmentai dar karta sukarpomi, sukeiciant restriktazes. Pagal tai, kaip sukarpyti segmentai uzdengia vienas kita, nustatoma ju issidestymo seka.  


24. DNR „PIRSTU ANTSPAUDAI“. JU PANAUDOJIMAS ASMENS IDENTIFIKAVIMUI IR GIMINYSTES RYSIO NUSTATYMUI.

DNR „pirstu antspaudai“: visu zmoniu chemine DNR sandara yra vienoda. Skiriasi tik azotiniu baziniu poru (A, C, T, G) isidestymo tvarka. Nukleotidai issidesto pasikartojancia tvarka, pas kiekviena zmogu truputi kitaip. Yra zinoma DNR segmentu kurie ypac skiriasi savo issidestymu pas skirtingus zmones. Naudojant PCR ar VNTR (variabiliu tandeminiu pasikartojimu skaiciu grupe) metoda galima istirti siuos segmentus ir pagal juos atskirti skirtingu zmoniu DNR.
Ju panaudojimas:

Tevystes rysio nustatymui naudojamas VNTR. Kadangi pasikartojimu skaicius paveldimas grieztai pagal Mendelio desnius, kiekviena asmeni galima identifikuoti pagal tam tikrose chromosomose esanti konkretu lokusa. Pvz. jei is tevo paveldeta chr. turi 12 pasikartojimu tam tikroje stiryje, o is motinos paveldeta – turi 15 pasikartojimu, tai vaiko genotipas bus 12/15 (12 pasikartojimu chr. paveldetoje is tevo, 15 pasikartojimu chr. paveldetoje is motinos).
Asmens identifikavimui taip pat naudojamas VNTR. Taip galima nustatyti ar itariamasis kaltas ar ne. Pagal nusikaltimo vietoje rasta krauja, plaukus, odos lasteles ir tt. galima identifikuoti asmeni, ivykdziusi nusikaltima. Sis metodas taip pat naudojamas identifikuoti zmones kai kitos identifikavimo pobudis neimanomas. Taciau sis metodas naudingas tik tada, kai turima DNR (pvz itariamojo) su kuria butu galima palyginti istirta DNR.   
25. POLIMERAZES GRANDININE REAKCIJA (PCR). DNR PRADMENYS.    

PCR: naudojama molekulinei diagnostikai atlikti. Is bandiniu isskyrus DNR atliekamas geno fragmento gausinimas. PCR reakcijai vykstant specialiame aparate (amplifikatoriuje), DNR denaturuojama (auksta temperatura nutraukia vandenilines jungtis). Po denaturacijos sumazinus temperatura ant DNR taikinio „uzseda“ specifiniai pradmenys (sintetines keliolikos nukleotidu ilgio viengrandines DNR molekules). Fermentas Taq polimeraze prie pradmenu jungia nukleotidus ir kopijuoja DNR fragmenta. Reakcija vykdoma ir kartojama ciklais: DNR denaturavimas – pradmens prisijungimas – pradmens pratesimas (DNR sinteze). Po 35 ciklu gaunama milijonai norimu tirti DNR molekuliu. Pagausintas DNR fragmentas yra naudojamas ieskant mutaciju bei diagnozuojant paveldimas ligas.   
1.Reakcijos tirpalas pakaitinamas tiek, jog dauginamos DNR grandinės atsiskiria viena nuo kitos.
2. Tirpalas vėl atvėsinamas. Dalis dauginamos DNR grandinių vėl sukimba, tačiau kitais atvejais ties dauginamą fragmentą ribojančiomis sekomis and dauginamos DNR užsėda tą seką atitinkantys pradmenys.
3. Tirpale esanti DNR polimerazė atpažįsta pradmenis ir pradeda juos tęsti, sintetindama naują DNR. Gaunamos dvigrandės DNR, kurių viena grandinė yra naujai susintetinta (padauginta).
4. Reakcijos tirpalas vėl pakaitinamas, kad DNR grandinės atšoktų viena nuo kitos. Gaunamas tirpalas, panašus į turėtą pirmąjame metodo žingsnyje, tačiau viengrandžių DNR fragmentų jau yra daugiau (prie anksčiau buvusių prisideda naujai susintetinti). Galima tęsti antrą ir po jo sekančius algoritmo žingsnius, kiekvieną kartą kaupiant vis daugiau DNR:

Kiekvienąkart pakartojus algoritmą, DNR tirpale padaugėja maždaug dvigubai. Todėl reakcija vadinama grandinine.


DNR pradmenys:  tai yra specifines keliolikos nukleotidu sekos kurios uzseda ant DNR veluojanciosios grandines kurios krypris yra priesinga replikacijai (3‘→5‘), kai DNR grandines atsiskiria. Juos uzsodina fermentas praimaze. DNR pradmenys turi 3‘   –OH gala, kuris butinas DNR polimerazei (kad ji pradetu veikti). Sie pradmenys veliau buna suskaidomi nukleaziu, ir trukius uztaiso DNR polimeraze.

26. ZMOGAUS GENOLAPIU SUDARYMAS (KROSOVERINIS, GENO DOZES EFEKTAS, SOMATINIU LASTELIU HIBRIDIZACIJA, RESTRIKCINES KARTOGRAMOS, CHEMINIS IR FERMENTINIS DNR SEKVENAVIMAS).

Krosoverinis: genolapiai yra genu seku ir santykiniu atstumu tarp genu schemos. Genai yra isdestyti chr. linijine tvarka. Mejozes pradzioje homologiniu chr. chromatides gali sudaryti chiazmas – persikriziuoti ir siose vietose apsikeisti aleliniais genais. Apsikeitimas genais vadinamas krosingoveriu. Santykini atsuma tarp genu galima isreiksti krosingoverio dazniu (atstumo vienetas – morganide). Mejozes pradzioje per visa chromatides ilgi gali susidaryti dvi ar daugiau chiazmu. Taigi gali ivykti krosingoveris tarp A ir B aleliu bei tarp B ir C aleliu. Tai vadinama dvigubu krosingoveriu. Jo resultatais pasinaudojus galima nustatyti genu seka chromosomoje. Atlikus analizuojamaji kryzminima sio tipo palikuoniu yra maziausiai. Genu seka nustatoma, analizuojant skirtingu hibridu genotipus.  

Geno dozes efektas: genu dozes skirtumu islyginimas skirtingose lytyse. Pateliu lastelese yra dvi XX chromosomos, o patineliu viena X ir viena Y. Zinduoliu Y chromosoma skiriasi ne tik morfologija, bet ir struktura. Didesne jos dali sudaro konstruktyvus heterochromatinas. Veikliu genu zymiai maziau negu X chromosomoje. Zinduoliu pateliu ankstyvoje embriogenezeje viena X chr. tampa fakultatyviu heterochromatinu ir stebima kaip Baro kunelis. Ji replikuojasi pries kiekviena dalijimas, bet yra genetiskai neaktyvi.

Somatiniu lasteliu hibridizacija: somatines lasteles suliejamos apardzius, arba visiskai suardzius lasteles apvalkaleli fermentais. Taciau suliejus tolimu organizmu lasteles, vieno is genomu chromosomos eliminuojasi. Suliejus zmogaus ir peles lasteles eliminuojasi zmogaus chromosomos. Suliejus zmogaus ir ziurkes lasteles, eliminuojasi ziurkes chromosomos. Sia savybe naudojamasi nustatant chromosoma, kurioje yra genas. Be to, chromosomu eliminacijos krypti galima valdyti.: to organizmo, kurio chromosomu eliminacija norima sukelti, somatines lasteles yra apsvitinamos jonizuojanciais arba UV spinduliais.  

Restrikcines kartogramos: chromosomose linijiskai kartografuojami ne genai, o restriktaziu pazinimo vietos. DNR skaidoma ivairiomis restriktazemis. Pagrindinis uzdavinys surikiuoti teisinga seka fragmentus, nustatomus elektroforeziskai. Tai atliekama ivairiais budais. Dazniausiai pirmiausia DNR suskaidoma i stambius segmentus dviem skirtingom restriktazemis, paskui gauti segmentai dar karta sukarpomi, sukeiciant restriktazes. Pagal tai, kaip sukarpyti segmentai uzdengia vienas kita, nustatoma ju issidestymo seka.   

DNR sekos nustatymas (sekvenavimas): Geno strukturos analize gali buti placiai taikoma tiriant ivairias paveldimas ligas. Jos pagalba issiaiskinta tiksli ligas lemianciu genu struktura. Nukleotidu sekai nustatyti DNR karpoma restriktazemis, ir nukleotidu seka nustatoma 100-200 nukleotidu il­gio vienagrandziuose fragmentuose. Sekvenuojant antrąją DNR gran­dine, patikrinama, ar pirmoji grandine yra sekvenuota teisingai. DNR sekvenavimo metodai: Maksamo ir Gilberto cheminiu metodu DNR fragmentas specifiskai kiekvienam nukleotidui suskaidomas cheminiu budu. Suskaidytu fragmentu galai fiksuojami (γ-P32) ATP, kuri prijungia fermentas polinukleotidkinaze. Keturiais budais suskaidyti fragmentai frakcionuojami elektroforeziskai . Kiekvienu budu - atskirai. Zymetieji fragmentai radioautografuojami ir skaitomi Sengerio fermentinis metodas. Sis metodas yra populiaresnis, juo dazniau naudojamasi. Sekvenuojamasis DNR fragmentas suskaidomas i mazesnius fragmentus. Prie klonuotų vienagrandziu segmentu 3' galo prijungiamas pradmuo, zymetas radioaktyviuoju izotopu arba fluorochromu.



27. ZMOGAUS KANDIDATINIU GENU PAIESKA – KELIAS NUO SINDROMO DIAGNOZES IKI GENO MUTACIJOS NUSTATYMO (BORJESSON-FORSMAN-LEHMAN SINDROMO PAVYZDZIU). 
BFL sindromas yra kai ivyksta PHF6 geno, esancio X chromosomoje, mutacija. Tai yra reta su X chromosoma sukibusi liga.  Pozymiai yra protinis atsilikimas, nutukimas, mesingi ausu speneliai, mazi lytiniai organai, plonejantys ranku pirstai ir sustoreje koju pirstai. Gimusio kudikio svoris yra normalus, bet daznai buna maitinimo problemu. Kartais galima mikro/makrocefalija ir zemas ugis. Protinis atsilikimas pasireiskia ankstyvoj vaikysteje; veliau buna vidutinio lygio. Pagrindiniai simptomai pasireiskia vaikui augant ir skirtingiems tos pacios seimos vaikams nebutinai yra tokie patys. Moterims heterozigotems pasireiskia problemos mokantis, taip pat ir BFL charakteringi koju ir ranku pirstai, mesingi ausu speneliai, bei ikritusios akys.  Gydymo nera, gydomi tik kai kurie simptomai.
Sindromo paveldijimas sukibes su X chromosoma. Bandant nustatyti geno mutacija moterims kartais buna itariamas Coffin-Lowry sindromas, taciau jame simptomai pasireiskia ankstyvoje vaikysteje, ausys nera padidejusios, protinis atsilikimas yra stipresnis. Bandant nustatyti BFL vyrams kartais buna itariamas Klainfelterio sindromas. Taciau atlikus citogenetinius tyrimus matoma, kad Klainfelterio kariotipas yra nenormalus, o BFL kariotipas - normalus, tad si liga buna atmetama. Prader-Willi sindromas turi kai kuriuos atitikmenis, bet maitinimo problemos jame pasireiskia stipriau, nutokimas taip pat buna didesnis, be to, Prader-Willi sindrome nepasireiskia BFL charakteringi ranku ir koju pirstai. Tad diagnozuojama liga yra BFL.
Toliau ieskant geno mutacijos atlikus Northern-blotinga buvo pastebeta PHF6 geno RNR isskirtine seka. PHF6 genas yra svarbus stuburiniuose. Jo daznas isreiskimas duoda suprasti jo svarba lastelineje veikloje. Siuo metu spekuliuojama, jog PHF6 yra svarbus lasteles augimui ir dalijimuisi. Visuose atliktuose BFL sindromo patikrinimuose matoma, kad BFL sindromas pasireiskia tik su PHF6 geno mutacija. Patikrinus pacientu motinas taip pat buvo rasta PHF6 geno mutacija, pasireiskianti skirtingu laipsniu del X chromosomos inaktyvacijos.  Taigi, galima daryt isvada, jog BFL sindromas sukeliamas PHF6 geno mutacijos. Kol kas nera nustatyta, kad PHF6 geno mutacijos sukeltu kitokias ligas, tik BFL sindroma.

28. ZMOGAUS GENU EXPRESIJA IVAIRIUOSE AUDINIUOSE. TOTIPOTENCINES (KAMIENINES) LASTELES. STUBURINIU GYVUNU KLONAVIMAS.

Zmogaus genu expresija ivairiuose audiniuose: zmogaus genai gali buti skirstomi i dvi dalis. Viena - genai aktyvus visose lastelese. Tokie genai vadinami ‘namu ukio’ genais. Ju veiklos produktai butini lasteliu gyvybinems funkcijoms. Kita dalis - genai, kurie veikia tik tam tikrose lastelese, arba tik tam tikromis salygomis. Jie vadinami ‘prabangos’ genais. Ju veiklos produktai butini lasteliu gyvybinems funkcijoms. Kita dalis - genai, kurie veikia tik tam tikrose lastelese, arba tik tam tikromis salygomis. Jie vadinami ‘prabangos’ genais. Ju veiklos produktai apsprendzia specifinius baltymus (apsprendzia lasteles specializacija) ir adaptacinius baltymus (ju deka lastele prisitaiko prie pakitusios aplinkos). Kuo lastele praejusi didesne diferenciacija, tuo joje maziau veikliuju (namu ukio) genu. Genai kurie buvo reikalingi diferenciacijai tampa nebereikalingi, ir neskaitant genu butinu lasteles gyvybinems funkcijoms, daugumoj funkcionuoja ‘prabangos’ genai.

Totipotencines (kamienines) lasteles: tai yra dar ne diferencijuotos lasteles, galincios issivystyti i bet kokia diferencijuota organizmo (zmogaus) lastele. Spermatazoidui apvaisinus kiausialaste susidaro totipotentine lastele, kuri dalijasi formuodama daugiau totipotentiniu lasteliu. Sios lasteles pradeda diferencijuotis po mazdaug 4 dienu.       

Stuburiniu gyvunu klonavimas: mikropipete issiurbiamas branduolys is kiausialastes ir iterpiamas branduolys is kitos lasteles. Norint sekmingai klonuoti stuburinius branduolio donorui reikia naudoti ne embrionine lastele. Normaliai donoro lasteles branduolys ir kitos lasteles citoplazma yra G2 stadijoje. Taciau esant siai stadijai i citoplazma iterpus branduoli vyksta nenumatytos reakcijos kurios sutrikdo normalu lasteliu cikla. Laikant abejas lasteles skurdzioje aplinkoje jos islieka G1 stadijoje ir iterpus branduoli i kitos lasteles citoplazma mitotinis ciklas vyksta normaliai. Pirma karta klonavimas buvo atliktas vienos avies tesmens branduoli implantuojant i kitos avies kiausialaste. Po keliu mitotiniu ciklu embrionas buvo implantuotas surogatinei aviai i gimda. Gimusi avis buvo identiska aviai is kurios imtas branduolys.

29. MEDICININE GENETINE KONSULTACIJA. VISUOTINIO GENETINIO SKRYNINGO PROGRAMOS. GATRI TESTAS.

Medicinine genetine konsultacija: istaiga teikianti informacija apie ligos ar defekto paveldejimo tikimybe. MGK tikslas – paveldimu ligu profilaktika. I MGK kreipiasi  tevai noredami zinoti kokia tikimybe, kad tam tikra liga ar defekta paveldes palikuonys, kokios galimybes sia liga gydyti ar diagnozuoti iki vaiko gimimo.
MGK organizacine struktura susideda is:
1. gydytojo genetiko kabineto.
2. procedutu kabineto.
3. citogenetiniu tyrimu labaratorijos.
4. boicheminiu tyrimu labaratorijos.
5. molekuliniu tyrimu labaratorijos.
 MGK uzdaviniai:
1. istirti probanda ir jo gamines
2. nustatyti ligos diagnose.
3. pateikti genetine prognoze seimai, t.y. apskaiciuoti sergancio palikuonio gimimo arba ligos pasikartojimo seimoje rizika.
4. tolesnis seimos stebejimas

Visuotinio genetinio skyningo programos:
1) prenatalinė diagnostika.
             a. invazine prenataline diagnostika, taikytina tik genetiskai rizikingiems nestumams. Tirama kariotipas ir DNR. Tyrimas atliekamas nestump pradzioje 8-11 savaite. (pvz. cistine fibroze, hemofilija)
             b. neinvazine prenataline diagnostika yra vaisiaus tyrimas ultragarsu. Atliekamas 18-20 nestumo savaite. Padeda nustatyti pacias aiskiausias vaisiaus vystymosi anomalijas. (pvz. smegenu vandene, daugiapistiskumas)
2) visuotinis salies naujagimiu tikrinimas paveldimoms medziagu apykaitos ligoms nustatyti (FKU, igimta hipotiroze).
3) asmenu tikrinimas ligos nesiotojams nustatyti (cistine fibroze).
4) suaugusiuju, kuriems dar neatsirado ligos simptomu tikrinimas (Huntingtono choreja).

Gatri testas taikomas tiriant autosomines paveldimas zmogaus ligas. Gatri testas yra spacifinis testas kai ant Gatri korteles buna uzlasinamas tiriamo zmogaus kraujas ir vykdomi molekuliniai genetiniai tyrimai.